過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒(紫外吸收法)說(shuō)明書

微量法100管/96樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：                           

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是最主要的H₂O₂清除酶，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。

測(cè)定原理：

H₂O₂在240nm下有特征吸收峰，CAT能夠分解H₂O₂，使反應(yīng)溶液240nm下的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間而下降，根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出CAT活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

工作液：液體24mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至240nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   測(cè)定前將CAT檢測(cè)工作液在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

3、   準(zhǔn)備96孔UV板一塊（非普通酶標(biāo)板，普通酶標(biāo)板只能透過(guò)可見(jiàn)光，不能透過(guò)紫外光，檢測(cè)波長(zhǎng)小于340nm務(wù)必使用UV板）。

4、   在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL樣本和190μL工作液，混勻，記錄240nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。計(jì)算ΔA＝A1-A2。

注意事項(xiàng)：出現(xiàn)負(fù)值怎么辦？

首先檢查吸光值是否超過(guò)3，如果超過(guò)3很可能是沒(méi)有用UV板，請(qǐng)換用UV板。如果未超過(guò)3，仍然出現(xiàn)負(fù)值則檢查反應(yīng)過(guò)程是否產(chǎn)生氣泡，氣泡多說(shuō)明酶活性太高，氣泡影響產(chǎn)生了負(fù)值，可以將樣本用提取液稀釋10倍后再檢測(cè)。如果稀釋樣本或反應(yīng)體系沒(méi)有產(chǎn)生氣泡仍然出現(xiàn)較小的負(fù)值，說(shuō)明該樣本測(cè)不到該酶活。

CAT活性計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）CAT活力的計(jì)算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(nmol/min/mL)= [ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=459×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中CAT活力計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=459×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=459×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(nmol/min/10⁴ cell)＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T =0.917×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：H₂O₂摩爾消光系數(shù)，4.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。

b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）CAT活力的計(jì)算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=918×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中CAT活力計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T =918×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=918×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=1.836×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：H₂O₂摩爾消光系數(shù)，4.36×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。